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腫瘤細胞培養(yǎng)基反復貼壁法和機械刮除法步驟

    根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。

　　（1）待細胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液；

　　（2）取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)基液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

　　（3）培養(yǎng)B瓶中細胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補加*培養(yǎng)基。

　　當三個瓶內都含有培養(yǎng)基液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。 

    是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：

　　（1）標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；

　　（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；

　　（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；

　　（4）注入培養(yǎng)基液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至*除掉為止。